如何利用ELISA篩選以及ELISA方法操作的注意事項(xiàng)有哪些呢?相信很多做實(shí)驗(yàn)的小伙伴都有這樣的疑問(wèn),佰利萊生物就給大家總結(jié)一下；

ELISA ,全稱酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),主要利用的是抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn),可分為植接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等。

下面以間接法為例進(jìn)行介紹:

一、方陣ELISA。用途:（1）融合后確定鼠血清中抗體效價(jià);（2）拿到單抗腹水后,需要建立ELISA方法時(shí)先要確定包被原及抗體的優(yōu)質(zhì)工作濃度。

經(jīng)典的方陣ELISA :將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度,結(jié)果OD值P/N> 2的均判為陽(yáng)性,選取OD值在1.0左右的那個(gè)Ag-Ab濃度為工作濃度,主要原因與酶標(biāo)儀靈敏度有關(guān)。

但是.對(duì)于抗原抗體而言,由于它們被稀釋成不同濃度,那么在理論上,每個(gè)抗原稀釋度情況下 ,總有一個(gè)抗體的稀釋度其OD值在1.0左右,那么到底選取哪一個(gè)OD值1.0左右的好呢 ?這就需要同時(shí)用藥物做個(gè)抑制來(lái)看,哪個(gè)濃度下抑制情況好,就取哪個(gè)抗原抗體濃度做工作濃度。

二、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA :在用方陣ELISA確定好抗原抗體最-佳結(jié)合濃度后就可以做間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA了,其目的主要是考察抗體的特異性、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算抗體對(duì)抗原的半數(shù)抑制、檢測(cè)限等參數(shù),也可以來(lái)檢測(cè)未知樣品中的抗體。方法是用確定的抗原包被,在加一抗時(shí)同時(shí)加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品( 一般是藥物),然后加二抗,顯色。用藥物(即標(biāo)準(zhǔn)品)濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo),繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算相關(guān)的參數(shù),之后就可以將未知的樣品所測(cè)OD值代入曲線方程求其中抗體的含量。通常這是建立ELISA檢測(cè)方法的必-備項(xiàng)目。

標(biāo)準(zhǔn)曲線可以繪成直線或是曲線(二次方程或三次方程)。通常是選取線性比較好的幾個(gè)點(diǎn)繪成直線。直線斜率越高說(shuō)明抗體的特異性及靈敏性好, R2

值越靠近1 ,則說(shuō)明線性關(guān)系好。曲線繪好后,有一些常用的參數(shù),如抑制率、半數(shù)抑制、檢測(cè)限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等等:

抑制率(%) =1- B/B0 ( B0為不含藥物的OD值; B為含有藥物的OD值)

標(biāo)準(zhǔn)差(SD) =[∑(Xi-B)2/(n- 1)] 1/2;

標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD) = SD/B

半數(shù)抑制:指用藥物(半抗原)去做競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)時(shí)呈現(xiàn)50%抑制效果時(shí)的藥物濃度。藥物濃度越低,而抑制率越高,則表示抗體對(duì)藥物的特異性越好,靈敏度也高。半數(shù)抑制濃度IC50對(duì)應(yīng)的OD值 : OD IC50= 0.5?B0

檢測(cè)下限(LOD)對(duì)應(yīng)的OD值:ODLOD=B0-3SD;

定量限(LOQ)對(duì)應(yīng)的OD值:ODLOQ=B0-10SD:

三、間接ELISA操作中具體注意的問(wèn)題:
間接ELISA-般有6個(gè)步驟:包被抗原、封閉、加一抗(在做競(jìng)爭(zhēng)時(shí)同時(shí)加入藥物)、加二抗、顯色、終止。其中除了加顯色和終止外,其余步驟之間都要進(jìn)行洗板。在這里面,每一步都非常重要 ,假如有一步疏忽都會(huì)造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。